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La sindrome di Usher, la forma genetica più comune di sordità. Focus sulla terapia genica

Introduzione e generalità

La sindrome di Usher comprende un gruppo di malattie ereditarie caratterizzate da una doppia compromissione sensoriale dei sistemi uditivo e visivo, con una presentazione variabile di disfunzione vestibolare in una proporzione di casi. È la causa più comune di perdita della vista e dell’udito combinate, rappresentando più della metà dei casi di sordocecità. Ha una prevalenza stimata tra 4 e 17 su 100000 persone in tutto il mondo.2,3 Inoltre, è stato stimato che rappresenti il ​​5% di tutte le sordità congenite e il 18% di tutti i casi di retinite pigmentosa (RP). La sindrome di Usher è sia clinicamente che geneticamente eterogenea ed è suddivisa in tre distinti sottotipi clinici, associati a un numero di loci genetici. I geni Usher codificano una varietà di proteine ​​che sono espresse nell’orecchio interno e nella retina, dove svolgono funzioni essenziali nello sviluppo e nella funzione sensoriali delle cellule ciliate e nel mantenimento dei fotorecettori.

Sindrome tipo 1

La sindrome di Usher di tipo 1 (Usher 1) è il sottotipo più grave in cui i pazienti mostrano ipoacusia neurosensoriale congenita bilaterale da grave a profonda, più frequentemente non progressiva, con areflessia vestibolare. Rappresenta circa il 25-44% di tutti i casi di sindrome di Usher. I neonati vengono rilevati attraverso lo schermo uditivo neonatale e, laddove non intrapresa/disponibile, la diagnosi viene spesso sospettata durante l’infanzia. L’areflessia vestibolare si riflette in uno sviluppo motorio ritardato e i bambini di solito non camminano autonomamente prima dei 18 mesi. Quando sono più grandi, compensano la loro areflessia vestibolare usando la vista. A causa della natura profonda della sordità, i bambini con Usher 1 traggono un beneficio limitato o nullo dagli apparecchi acustici e la maggior parte dei pazienti con Usher 1 sarebbero utenti del linguaggio dei segni se la perdita dell’udito non fosse trattata effettivamente.

Sindrome tipo 2

La sindrome di Usher di tipo 2 (Usher 2) è la forma più comune del disturbo, rappresentando oltre la metà di tutti i casi. L’ipoacusia neurosensoriale è tipicamente descritta come inclinata, da lieve a moderata nelle basse frequenze e da grave a profonda nelle alte frequenze. La perdita dell’udito è congenita e i bambini vengono rilevati attraverso lo schermo uditivo neonatale, tuttavia, se il rilevamento non disponibile può essere trascurato fino alla fine della prima decade di vita a causa della configurazione ad alta frequenza e del grado di perdita dell’udito. Sebbene si pensi che non sia progressivo, ci sono prove che indicano una progressione della perdita dell’udito nel corso degli anni, in particolare nell’Usher di tipo 2A. I bambini traggono beneficio dagli apparecchi acustici convenzionali e spesso hanno un’acquisizione del parlato quasi normale.

Sindrome tipo 3

La sindrome di Usher di tipo 3 (Usher 3) è rara nella maggior parte delle popolazioni, rappresentando circa il 2-4% di tutti i casi, sebbene sia particolarmente diffusa in Finlandia e tra gli ebrei ashkenaziti. Le caratteristiche audiovestibolari sono le più variabili dei sottotipi Usher. La perdita dell’udito è di esordio post-linguale e di solito viene rilevata nella prima decade di vita, sebbene l’esordio può essere ritardato fino alla vita adulta. È tipicamente di natura progressiva, con audiogrammi che mostrano le alte frequenze più colpite o una configurazione a forma di U. Le anomalie vestibolari sono presenti in circa la metà dei pazienti, sebbene la maggior parte riporti un’età normale di deambulazione indipendente. Gli apparecchi acustici sono utili nelle prime fasi della malattia, ma in caso di perdita progressiva dell’udito possono essere necessari impianti cocleari.

Genetica della malattia

Tutti i tipi di sindrome di Usher sono ereditati con modalità autosomica recessiva. Ad oggi, sono stati identificati almeno 10 geni-malattia, tra cui sei geni Usher 1, tre geni Usher 2 e un gene Usher 3. Storicamente, si è scoperto che il sequenziamento tradizionale di Sanger di tutti gli esoni del gene Usher fornisce una diagnosi genetica per oltre l’80% delle famiglie Usher,33,34 ma questo richiede tempo, è costoso, in particolare per grandi coorti di pazienti. I test basati su microarray hanno fornito un rilevamento di circa il 33% per i pazienti Usher, ma possono solo eseguire lo screening per le mutazioni note. Attualmente, ci sono nove loci (USH1B¬J) noti per essere coinvolti in Usher 1. I geni identificati per sei di questi loci sono i seguenti: MYO7A (USH1B), USH1C (USH1C), CDH23 (USH1D), PCDH15 (USH1F), USH1G (USH1G) e CIB2 (USH1J). Di questi geni, MYO7A è la causa più frequente di Usher 1, rappresentando più della metà dei casi. I loci USH1E, USH1H e USH1K sono stati mappati rispettivamente sui cromosomi 21q21, 15q22-23 e 10p11.21-q21.1, ma i geni devono ancora essere identificati. Vale la pena notare che varianti con perdita di funzione dei due geni CIB2 sono state riportate in pazienti con ipoacusia non sindromica recessiva (DFNB48) ma senza sintomi retinici.

Tre geni alla base di Usher 2 sono stati identificati come USH2A (USH2A), ADGRV1 (USH2C)52 e WHRN (USH2D). Le mutazioni USH2A sono la causa più comune della sindrome di Usher, rappresentando circa l’80% dei casi di Usher 2. Inoltre, è stato riportato che il dominio 7 contenente PDZ (PDZD7) agisce come modificatore della malattia e contribuisce a una forma digenica di Usher 2. CLRN1 (o USH3A) è l’unico gene attualmente confermato per causare Usher 3, con due mutazioni prevalenti, p.(Y176*) e p.*N48K), che rappresentano rispettivamente la maggior parte dei casi nei pazienti finlandesi ed ebrei ashkenaziti. Una variante missenso omozigote dell’istidil-tRNA sintetasi (HARS) è stata riportata anche in due pazienti con un fenotipo compatibile con Usher 3 (a volte indicato come USH3B).

I geni Usher codificano un numero di proteine strutturalmente e funzionalmente distinte; questi includono una proteina motoria che lega l’actina (miosina VIIA, USH1B40), proteine ​​di scaffolding (harmonin, USH1C; sans, USH1G; whirlin, USH2D53), proteine ​​di adesione/transmembrana cellulare (caderina 23, USH1D; protocaderina 15, USH1F; usherin, USH2 clarin-1, USH3A56), un recettore di adesione accoppiato a protein G (ADGRV1, USH2C52) e una proteina legante il calcio e l’integrina (CIB2, USH1J46). La maggior parte è espressa come molteplici varianti di giunzione e proteine ​​in una gamma di tessuti, ma tutte le proteine ​​Usher sono presenti nell’orecchio interno e nella retina dove è stato scoperto che la maggior parte interagisce e forma complessi che si localizzano in posizioni subcellulari nei neuroni sensoriali ciliati, cioè, cellule ciliate dell’orecchio interno e fotorecettori retinici. Anche la miosina VIIA è una proteina RPE essenziale e l’evidenza suggerisce che clarin¬1 è limitato alla glia di Müller retinica. Vari studi hanno indicato il coinvolgimento delle proteine ​​Usher in una serie di processi, tra cui la coesione, la meccanotrasduzione, la maturazione sinaptica e il trasporto di proteine ​​e organelli.

Aggiornamenti sulla funzione della proteina SANS/USH1G

Da circa 25 anni, il gruppo di ricerca guidato dal professor Uwe Wolfrum dell’Istituto di fisiologia molecolare dell’Università Johannes Gutenberg di Mainz (JGU) conduce ricerche sulla sindrome di Usher. Lavorando in collaborazione con il gruppo guidato dal professor Reinhard Lührmann presso l’Istituto Max Planck di chimica biofisica di Göttingen, il suo team ha ora identificato un nuovo meccanismo patogeno che porta alla sindrome di Usher. Hanno scoperto che la proteina SANS di tipo 1G della sindrome di Usher svolge un ruolo cruciale nella regolazione del processo di splicing. Inoltre, i ricercatori sono stati in grado di dimostrare che i difetti nella proteina SANS possono portare a errori nello splicing dei geni legati alla sindrome di Usher, che possono provocare la malattia. Precedenti ricerche intraprese dal team di Wolfrum hanno stabilito che il SANS agisce come una proteina dell’impalcatura.

SANS ha più domini a cui possono agganciarsi altre proteine, garantendo così una corretta funzione cellulare. Le mutazioni nel gene USH1G/SANS portano a malfunzionamenti delle cellule ciliate uditive e vestibolari nell’orecchio interno e delle cellule fotorecettrici della retina, che sono responsabili dei difetti sensoriali sperimentati dai pazienti con sindrome di Usher. Ora lo stesso team ha scoperto che la SANS interagisce con i fattori di splicing per regolare lo splicing del pre-mRNA. Lo splicing è un processo importante nel percorso dal gene codificante alla biosintesi delle proteine. Ciò che accade durante lo splicing è che gli introni non codificanti vengono rimossi dal pre-mRNA inizialmente trascritto o, nel caso di splicing alternativo, vengono esclusi gli esoni che non sono necessari per la successiva variante proteica. L’mRNA risultante viene quindi utilizzato per la biosintesi delle proteine. Il processo di splicing è catalizzato nel nucleo dallo spliceosoma, una macchina molecolare dinamica e altamente complessa che viene successivamente assemblata durante il processo di splicing da un numero di sottocomplessi di componenti proteici e di RNA.

Gli scienziati sono rimasti sorpresi dalla scoperta che il SANS non è solo un componente del trasporto alle ciglia sulla superficie della cellula, ma è anche attivo nel nucleo e può modulare anche lì il processo di splicing. Nel nucleo cellulare, il SANS è responsabile del trasferimento dei complessi tri-snRNP, o componenti dei sottocomplessi spliceosomiali, dai corpi di Cajal, una sorta di catena di montaggio molecolare, alle cosiddette macchioline nucleari. In questo compartimento, i complessi tri-snRNP si legano all’assemblaggio dello spliceosoma per attivarlo successivamente. È probabile che anche il SANS sia coinvolto nel riciclaggio dei componenti del tri-snRNP negli organismi di Cajal. L’assenza di SANS e anche di mutazioni patogene del gene USH1G/SANS impediscono che lo spliceosoma venga correttamente assemblato e attivato sequenzialmente. Questo, a sua volta, sopprime il corretto splicing di altri geni correlati alla sindrome di Usher, portando infine alla loro disfunzione e quindi allo sviluppo del disturbo.

Clinica e diagnosi medica

In tutti i tipi di sindrome di Usher, i reperti audiologici vengono rilevati/presenti prima dei segni e dei sintomi oftalmologici. I bambini e gli adulti con sindrome di Usher non presentano dismorfismi e il disturbo viene comunemente scambiato per una perdita dell’udito neurosensoriale isolata non sindromica. Avranno spesso le indagini eziologiche iniziali per la perdita dell’udito, che includono test del citomegalovirus (CMV) e risonanza magnetica (MRI), test genetici per GIB2 e mutazioni mitocondriali m.1555A>G ed elettrocardiografia (ECG) in alcuni pazienti, che dovrebbe essere normale. Le indagini iniziali per l’ipoacusia neurosensoriale bilaterale includono anche la valutazione oftalmologica, che nei primi anni può essere normale a seconda del sottotipo di Usher. La diagnosi di Usher 1 deve essere sospettata in qualsiasi bambino con ipoacusia neurosensoriale profonda bilaterale e tappe motorie ritardate, anche se lo screening oftalmologico iniziale è normale. Usher 2 dovrebbe essere preso in considerazione nei pazienti con la tipica configurazione inclinata della perdita dell’udito. La diagnosi di Usher 2 o 3 viene effettuata dopo che i sintomi o i segni visivi sono stati rilevati attraverso l’esame di routine o l’elettroretinografia (ERG).

La terapia genica: fattibile ma difficoltosa

Sebbene attualmente non sia disponibile una cura, ci sono numerose strategie terapeutiche in fase di sviluppo per la RP correlata a Usher e altre malattie retiniche ereditarie (IRD): queste includono la sostituzione genica, l’editing genico, la soppressione senza senso e gli approcci basati su oligonucleotidi antisenso (ASO). L’occhio è un organo attraente per le applicazioni terapeutiche grazie alla sua accessibilità e al privilegio immunitario, mentre la storia naturale della malattia con fotorecettori conici conservati nella fovea fino a una fase successiva fornisce una finestra ideale per l’intervento. La maggior parte degli studi terapeutici per la sindrome di Usher sono stati eseguiti utilizzando cellule derivate dal paziente (tipicamente fibroblasti) o topi mutanti, di cui ce ne sono molti, con almeno uno esistente per ciascun gene causativo.65,66 La maggior parte dei topi Usher mostra perdita dell’udito neurosensoriale e vestibolare fenotipo che ricorda le loro controparti umane, con solo un numero limitato che mostra una degenerazione retinica progressiva. Nonostante ciò, hanno comunque aiutato nella valutazione dei potenziali trattamenti.

Terapia genica: modulazione e modifica genica

  1. Oligonucleotidi antisenso e interferenza RNA

La tecnologia dell’interferenza dell’RNA (RNAi) utilizza piccole molecole di RNA per guidare il silenziamento specifico della sequenza di un gene bersaglio legandosi alla sequenza complementare e inducendo la degradazione dell’mRNA. Questo approccio ha dimostrato di mirare efficacemente ai geni terapeuticamente rilevanti, in particolare quelli con varianti ereditate in modo autosomico dominante, con guadagno di funzione. L’uso dell’RNAi come approccio terapeutico per la sindrome di Usher sarà molto più limitato poiché si tratta di una malattia autosomica recessiva derivante da proteine ​​difettose o assenti. Gli oligonucleotidi antisenso (ASO) sono brevi sequenze di RNA/DNA che possono legarsi a filamenti di RNA complementari, inibendo la traduzione. La terapia ASO è stata utilizzata principalmente in modelli murini di USH1C, in particolare per prevenire la trascrizione di una mutazione c.216G>A che crea un sito di giunzione aberrante arresto prematuro del gene. Vari studi hanno dimostrato il salvataggio sia uditivo che vestibolare.

  1. Terapia genica: sostituzione genica

Consegna virale

Quando si seleziona un vettore virale, devono essere considerati molti fattori. La capacità di carico del vettore deve essere in grado di adattarsi alla lunghezza del gene sostitutivo e il vettore deve trasdurre efficacemente il tipo di cellula bersaglio all’interno del corpo. Anche l’immunoreattività del virus è un fattore importante, con un vettore ideale che suscita una risposta immunitaria minima o nulla.

Tipi di virus utilizzati nella terapia genica

Diversi vettori virali sono stati esplorati nell’orecchio interno tra cui adenovirus, virus adeno-associato (AAV), retrovirus, HSV e lentivirus. Poiché non si integrano nel genoma dell’ospite, i vettori di adenovirus non sono in grado di conferire l’espressione a lungo termine del gene bersaglio. Tuttavia, rispetto agli adenovirus, i virus adeno-associati (AAV) sono emersi come un buon vettore candidato a causa della loro ridotta risposta immunitaria e della capacità di conferire un’espressione prolungata del prodotto genico nell’orecchio interno.

Vettori virali per l’orecchio interno (Anc80L65)

Sebbene sia stato osservato che l’immunoreattività all’AAV è bassa, in quanto virus endemico, la prevalenza dell’immunità preesistente all’AAV si avvicina al 50% in alcune popolazioni. Anc80L65, l’antenato dei sierotipi AAV 1, 2, 8 e 9, è stato identificato da Zinn et al. attraverso l’analisi in silico come candidato ideale grazie alla sua capacità di eludere l’immunità esistente per fornire meglio i geni all’orecchio interno. Inoltre, in un modello murino di USH1C (c.216G > A), l’AAV2/Anc80L65 ha ottenuto la stabilizzazione delle cellule ciliate e dei fasci, riducendo la degenerazione e preservando la funzione. È stato scoperto che il virus Anc80 supera tutti gli altri AAV nel livello di espressione nelle cellule ciliate interne ed esterne in un modello murino con espressione stabile a un mese di follow-up. Oltre all’espressione nella coclea, il virus ha anche mostrato espressione nel tessuto vestibolare umano. Altri virus sono stati esplorati; un AAV2.7m8 sintetico è stato utilizzato con successo nell’orecchio interno per colpire i peli cocleari e le cellule di supporto, e AAV9-PHP.B ha salvato la perdita dell’udito nei geni Usher 3A (CLRN-1). È noto che gli AAV nell’orecchio interno trasducono più efficacemente le cellule ciliate interne (IHC), rispetto alle cellule ciliate esterne (OHC), con AAV2 e AAV8 che forniscono la consegna più efficace.

  1. Salto dell’esone

Spesso in una grande proteina, come molte delle proteine ​​correlate a Usher, c’è solo una piccola mutazione che porta alla perdita di funzione dell’intera proteina. Questi grandi proteine ​​spesso contengono anche ridondanza di subunità. È stato così riconosciuto che esiste potenziale per saltare tutti gli esoni che contengono una mutazione e finire comunque con un funzionale o proteina parzialmente funzionale. Il salto è stato effettuato mediante l’uso di piccoli RNA, oligonucleotidi antisenso (ASO) e CRISPR. Il salto dell’esone ha avuto un certo successo nell’affrontare malattie come la distrofia muscolare di Duchenne e ha un potenziale per l’uso nella sindrome di Usher. La variante intronica profonda c.7595-2144A>G in USH2A provoca un sito donatore di splicing nell’introne 40 che a sua volta provoca l’aggiunta di un falso esone di 152 basi nel trascritto. Questo porta a un arresto prematuro e a una proteina non funzionale.

Slijkerman et al. sono stati in grado di utilizzare un ASO per colpire lo pseudoesone e saltarlo efficacemente per ripristinare l’espressione di USH2A di tipo selvaggio nei fibroblasti colpiti. Questa si è rivelata un’opzione efficace per valutare clinicamente le mutazioni c.7595-2144A>G USH2A, tuttavia si tratta di una mutazione relativamente rara. Inoltre, qualsiasi terapia che coinvolga ASO richiederebbe veicoli di consegna appropriati e dosi ripetute. I metodi basati su piccole molecole per il trattamento della sindrome di Usher hanno incluso l’uso di farmaci che inducono la lettura attraverso la traduzione (TRID), che si legano al macchinario traslazionale e sono in grado di indurre l’inserimento di un amminoacido nel sito dei codoni di stop prematuri, consentendo la lettura attraverso mutazioni senza senso.

Questi farmaci a piccola molecola includono ataluren (PTC124) e aminoglicosidi designer (composti tipo lo NB54). Un’ulteriore piccola molecola che è stata di interesse per il trattamento della sindrome di Usher, nota come BioFocus 844 (BF844), è stata identificata attraverso lo screening ad alto rendimento basato su cellule come in grado di stabilizzare la proteina Clarin defective1 difettosa prodotta dalla comune variante missenso N48K. BF844 ha dimostrato di proteggere dalla perdita progressiva dell’udito quando somministrato per via intraperitoneale a un modello di topo knock-in Usher 3.

Sfide di consegna del prodotto genico

Un ostacolo nella progressione dalla terapia molecolare all’uso clinico è la consegna efficiente delle molecole bioattive alle cellule bersaglio corrette. La complessità della barriera boni-labirintica rappresenta una sfida per la somministrazione dei farmaci, ma la sua struttura unica crea anche opportunità per nuovi approcci. In precedenza, si credeva che l’orecchio interno fosse immune al privilegio a causa della mancanza di drenaggio linfatico dalla coclea, sebbene ora si sappia che i macrofagi migrano e risiedono nella coclea. Ciò può rendere la coclea più suscettibile alla consegna virale con un potenziale ridotto per l’impegno immunitario. La risposta immunitaria alle piattaforme di consegna virale è complessa ed è difficile determinare la sicurezza a lungo termine dell’espressione del transgene.

Sono state proposte molteplici strategie per ridurre la risposta immunitaria ai vettori virali AAV, inclusa la selezione di soggetti naïve all’AAV, l’uso di AAV altamente efficienti e sierotipi AAV ingegnerizzati o la somministrazione di farmaci immunosoppressori in combinazione con la consegna del vettore virale. La consegna fisica di queste terapie pone anche una serie di sfide. La coclea si trova nell’osso temporale e come tale deve essere accessibile chirurgicamente. Esistono diverse tecniche per fornire queste potenziali terapie all’orecchio interno, tra cui iniezioni di membrane a finestra rotonda e a finestra ovale, canalostomia con iniezione nel canale semicircolare posteriore e iniezione di otricolo. I metodi più comuni e promettenti che supportano la diffusione delle terapie attraverso la coclea, sono le iniezioni di membrane a finestra rotonda e a finestra ovale come l’iniezione di finestre rotonde.

  • a cura del Dr. Gianfrancesco Cormaci, PhD, specialista in Biochimica Clinica.

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Dott. Gianfrancesco Cormaci
- Laurea in Medicina e Chirurgia nel 1998 (MD Degree in 1998) - Specialista in Biochimica Clinica nel 2002 (Clinical Biochemistry residency in 2002) - Dottorato in Neurobiologia nel 2006 (Neurobiology PhD in 2006) - Ha soggiornato negli Stati Uniti, Baltimora (MD) come ricercatore alle dipendenze del National Institute on Drug Abuse (NIDA/NIH) e poi alla Johns Hopkins University, dal 2004 al 2008. - Dal 2009 si occupa di Medicina personalizzata. - Guardia medica presso strutture private dal 2010 - Detentore di due brevetti sulla preparazione di prodotti gluten-free a partire da regolare farina di frumento immunologicamente neutralizzata (owner of patents concerning the production of bakery gluten-free products, starting from regular wheat flour). - Responsabile del reparto Ricerca e Sviluppo per la società CoFood s.r.l. (leader of the R&D for the partnership CoFood s.r.l.) - Autore di un libro riguardante la salute e l'alimentazione, con approfondimenti su come questa condizioni tutti i sistemi corporei. - Autore di articoli su informazione medica e salute sui siti web salutesicilia.com, medicomunicare.it e in lingua inglese sul sito www.medicomunicare.com
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