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La terapia “saltatoria” per la fibrosi cistica: a caccia di molecole correttive del gene

Un farmaco sperimentale riportato su Nature Communications suggerisce che un “percorso è chiaramente realizzabile” per trattare casi attualmente non trattabili di malattia della fibrosi cistica causata da mutazioni nonsenso. Ciò include circa l’11% dei pazienti con fibrosi cistica, nonché pazienti con altre malattie genetiche, tra cui la distrofia muscolare di Duchenne, la beta-talassemia e numerosi tipi di cancro, anch’essi causati da mutazioni nonsenso. Il farmaco è una piccola molecola con un nuovo meccanismo di azione. Per capire come una mutazione senza senso causi la malattia – e come funziona il farmaco sperimentale per sopprimere la mutazione – è necessario uno sguardo da vicino al meccanismo biologico che produce le proteine ​​all’interno di una cellula. Una proteina è una catena di centinaia di amminoacidi che poi si ripiega nella sua forma corretta e si sposta al suo posto giusto per svolgere la sua funzione. La catena è costituita, anello per anello, da ribosomi che leggono una sequenza per la proteina trasportata sull’RNA messaggero. Una mutazione genetica che modifica una delle basi nucleotidiche dell’RNA messaggero può causare l’inserimento di un amminoacido errato nella catena proteica, alterandone la funzione.

Quella sequenza indica quale dei 20 diversi amminoacidi aggiungere a ciascun collegamento, uno per uno. Nella malattia della fibrosi cistica, le mutazioni influenzano la proteina CFTR che funziona sulla superficie delle cellule polmonari per regolare il flusso di acqua verso il muco. Un CFTR malfunzionante o assente crea muco molto appiccicoso che permette infezioni ai polmoni. I codoni di terminazione prematura senza senso studiati da Bedwell e Rowe causano un problema diverso: la mutazione costringe il ribosoma a interrompere la sintesi proteica a metà corso, producendo una proteina incompleta. Provoca anche il decadimento dell’mRNA mediato da nonsenso. Questo è il motivo per cui gli scienziati del Dipartimento di Biochimica e Genetica Molecolare di Birmingham, dell’Università dell’Alabama, e il loro team volevano trovare composti di piccole molecole che avrebbero fatto saltare il ribosoma attraverso la mutazione di arresto prematura senza senso, consentendo al ribosoma di continuare la sintesi completa della proteina. Speravano di trovare agenti readthrough che abbiano un nuovo meccanismo e funzionino meglio di quelli attuali, come gli antibiotici aminoglicosidici, che hanno scarsa efficacia.

I ricercatori hanno utilizzato cellule di ratto che trasportavano un gene modificato da un gambero per testare centinaia di migliaia di composti. Il gene codifica per la luciferasi NanoLuc, ma con una modifica per posizionare un codone di terminazione prematura a metà del gene. Una piccola molecola che induce il ribosoma a leggere attraverso l’arresto prematuro produrrebbe luciferasi intatta, facendo risplendere le cellule di una brillante luminescenza. Questo gene reporter ha permesso al team di testare 771.345 composti, utilizzando uno screening ad alto rendimento. Dei 180 composti che mostravano attività di readthrough, la piccola molecola SRI-37240 era la più attiva. I ricercatori hanno scoperto che SRI-37240 ha ripristinato la funzione dei geni CFTR umani con mutazioni del codone di terminazione prematura, come testato in colture di cellule di ratto. Ha aumentato significativamente la quantità di proteina CFTR e ha leggermente aumentato la quantità di RNA messaggero CFTR. Un aminoglicoside chiamato G418 è noto per aiutare la lettura delle mutazioni premature del codone e i ricercatori hanno scoperto che SRI-37240 e G418 hanno agito sinergicamente per ripristinare la funzione CFTR.

Il team ha scoperto che SRI-37240 induce una pausa prolungata ai codoni di stop dell’RNA messaggero e inibisce la terminazione della sintesi proteica ai codoni di terminazione prematura senza stimolare il readthrough ai normali codoni di terminazione trovati alla fine della sequenza di codifica delle proteine ​​sull’RNA messaggero. I chimici medicinali hanno sintetizzato 40 derivati ​​di SRI-37240 e uno, SRI-41315, era più potente e mostrava migliori caratteristiche fisico-chimiche. Nelle linee cellulari umane con il gene reporter NanoLuc, SRI-41315 ha mostrato un’efficienza di lettura molto maggiore rispetto a SRI-37240 e SRI-41315 ha agito in sinergia con G418. I complessi ribosomiali includono proteine ​​ribosomiali e altre proteine ​​che funzionano come fattori di terminazione, fattori di traduzione e fattori di decadimento dell’mRNA mediati da nonsenso. I ricercatori hanno esaminato l’abbondanza di sette di quelle proteine ​​e hanno scoperto che SRI-41315 ha ridotto drasticamente un singolo fattore di terminazione chiamato eRF1, attraverso un percorso dipendente dalla degradazione del proteasoma. Questo nuovo meccanismo non è stato visto in precedenza per un agente farmacologico e la molecola in sé, infatti, non interagisce con la proteina eRF1. In verità, i ricercatori non sanno quale sia il suo diretto bersaglio.

Per prevedere l’efficacia clinica per la fibrosi cistica, i ricercatori hanno testato cellule epiteliali bronchiali umane primarie che avevano codoni di terminazione prematura CFTR endogeni. Né SRI-37240 né SRI-41315 da soli hanno aumentato la funzione CFTR, ma SRI-41315 insieme a G418 hanno mostrato un aumento significativo della funzione. Anche il già noto effetto readthrough degli aminoglicosidi è limitato perché questi antibiotici non ripristinano i livelli terapeutici di CFTR, inoltre devono essere somministrati per via endovenosa e possono essere tossici per il rene e l’apparato uditivo. Sfortunatamente, i due composti hanno avuto un effetto deleterio sulla conduttanza ionica mediata dal canale epiteliale del sodio (ENaC), che limita lo sviluppo nella loro forma attuale come trattamento per la fibrosi cistica. Tuttavia, queste molecole diventeranno un punto di partenza per direzionare la loro chimica in modo più selettivo e verso un bersaglio proteico o enzimatico conosciuto che controlla la maturazione della proteina CFTR.

  • A cura del Dr. Gianfrancesco Cormaci, PhD, specialista in Biochimica Clinica.

Pubblicazioni scientifiche

Sharma J et al. Nature Commun 2021 Jul 16; 12(1):4358.

Mutyam V et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2021; 64(5):604-616. 

Sharma J et al. Eur J Med Chem. 2020 Aug 15; 200:112436.

Dott. Gianfrancesco Cormaci
- Laurea in Medicina e Chirurgia nel 1998 (MD Degree in 1998) - Specialista in Biochimica Clinica nel 2002 (Clinical Biochemistry residency in 2002) - Dottorato in Neurobiologia nel 2006 (Neurobiology PhD in 2006) - Ha soggiornato negli Stati Uniti, Baltimora (MD) come ricercatore alle dipendenze del National Institute on Drug Abuse (NIDA/NIH) e poi alla Johns Hopkins University, dal 2004 al 2008. - Dal 2009 si occupa di Medicina personalizzata. - Guardia medica presso strutture private dal 2010 - Detentore di due brevetti sulla preparazione di prodotti gluten-free a partire da regolare farina di frumento immunologicamente neutralizzata (owner of patents concerning the production of bakery gluten-free products, starting from regular wheat flour). - Responsabile del reparto Ricerca e Sviluppo per la società CoFood s.r.l. (leader of the R&D for the partnership CoFood s.r.l.) - Autore di un libro riguardante la salute e l'alimentazione, con approfondimenti su come questa condizioni tutti i sistemi corporei. - Autore di articoli su informazione medica e salute sui siti web salutesicilia.com, medicomunicare.it e in lingua inglese sul sito www.medicomunicare.com
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