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Aggiornamenti COVID: l’immunità negli ex-malati, la vaccinazione dopo la malattia ed i tests salivari

L’immunità avviene correttamente negli ammalati sintomatici?

La risposta immunitaria alla SARS-CoV2 è complessa e variabile in base alla gravità della malattia e l’immunopatologia del COVID-19 grave è stata ben studiata sin dall’inizio della pandemia. Un ampio spettro di risposte immunitarie anormali e disregolate è stato osservato tra i malati da moderati a critici. Tuttavia, non è chiaro se esista una variabilità simile negli asintomatici o nei malati lievi. In una ricerca preliminare, è stata confrontata la risposta immunitaria di pazienti COVID-19 lievi e ospedalizzati, scoprendo che la risposta precoce delle cellule T è un indicatore vitale della gravità del COVID. Il gruppo ha riunito 14 e 63 individui con COVID-19 asintomatico o lieve, rispettivamente, 15 pazienti ospedalizzati e 26 individui sani, con il sangue prelevato prima entro tre giorni dalla diagnosi PCR e una seconda volta tre settimane dopo. I livelli di citochine e chemochine sono stati determinati mediante test di immunoassorbimento enzimatico, oltre a neutralizzare l’anticorpo e le IgG contro il virus. Ben 484 firme di cellule immunitarie all’interno dei campioni sono state colorate e contate mediante citometria a flusso, consentendo al gruppo di valutare la frequenza del campione e il tipo di cellula immunitaria.

In accordo con altri rapporti, il gruppo ha notato una drammatica differenza nell’analisi dell’emocromo intero tra quelli con COVID-19 lieve o asintomatico rispetto ai ricoverati, che esprimevano un numero ridotto di linfociti e globuli rossi, con elevata proteina C-reattiva, sangue bianco livelli cellulari e piastrinici. Nel sangue raccolto il giorno 1, solo il 45% circa dei primi ha mostrato titoli anticorpali leggermente migliorati contro SARS-CoV-2, mentre il 93% dei ricoverati ha mostrato titoli significativamente migliorati contro la proteina spike in particolare. I campioni raccolti tre settimane dopo hanno mostrato titoli anticorpali significativamente migliorati per entrambi i gruppi. Oltre a prendere di mira SARS-CoV2, gli anticorpi possono essere distribuiti dal sistema immunitario che prende di mira il recettore ACE2 nel tentativo di bloccare l’ingresso del virus in una cellula ospite, e un aumento del titolo di questi anticorpi è stato riscontrato tra COVID-ospedalizzati. Solo 19 pazienti. Il profilo immunitario cellulare dei pazienti asintomatici è risultato essere molto simile a quello dei controlli sani, con l’unica differenza significativa nella diminuzione della frequenza del costimolatore delle cellule T inducibile recante cellule T CD8.

Sono state riscontrate differenze nella frequenza di diversi sottogruppi di cellule T CD8 tra quelli con lieve COVID-19 e controlli sani, inclusi Ki67+ e CD38+, che indicano cellule T antigene-specifiche attive e proliferanti. La frazione di cellule T CD4 responsivi al Th1 è stata aumentata nei pazienti lievi sin dal primo momento, e la frequenza delle cellule che presentano e secernono l’antigene è stata maggiore. La frequenza delle cellule T CD38+ CD8 e delle cellule dendritiche mature al giorno, era fortemente correlata con titoli elevati di anticorpi anti-SARS-CoV-2 mirati al nucleocapside in pazienti lievi. Allo stesso tempo, questa tendenza non è risultata vera per i pazienti ospedalizzati con COVID-19. I monociti non classici erano presenti con alta frequenza nel 40% dei pazienti lievi e solo nel 10% dei pazienti ospedalizzati, e anche le cellule presentanti l’antigene erano presenti con una frequenza molto maggiore tra i pazienti lievi. La frequenza delle cellule funzionali e dei precursori mieloidi è risultata complessivamente ridotta, suggerendo una ridotta capacità di presentazione dell’antigene.

Anche la frequenza delle cellule T CD4 e delle cellule natural killer è stata ridotta in modo simile tra i ricoverati. Sebbene la risposta immunitaria cellulare dei ricoverati sia compromessa, il gruppo ha riscontrato una robusta risposta delle cellule B di memoria a commutazione di classe in questo gruppo rispetto a quella leggermente sintomatica e, data la forte risposta anticorpale osservata, il gruppo ha concluso che le cellule che secernono anticorpi non sono compromessi nelle primissime fasi dell’infezione da SARS-CoV-2 anche nei ricoverati. Come nel gruppo lieve, le cellule T CD8 sono state potenziate nei guariti. I ricercatori suggeriscono che le successive principali carenze osservate siano il risultato di cellule dendritiche e natural killer danneggiate. È stato osservato un aumento di molte chemochine e citochine correlate all’infiammazione tra i pazienti sia lievi che ospedalizzati, come l’interleuchina-6, l’interleuchina-10, la proteina 10 inducibile dall’interferone-gamma (IP10) e l’interferone di tipo 1, che sono stati tutti addizionati e stabilizzati a livelli normali nel gruppo lieve, mentre i livelli sono rimasti elevati nei ricoverati, indicando l’entità alla quale la risposta immunitaria è stata disregolata.

Nessun cambiamento significativo nei livelli di queste citochine è stato osservato nel gruppo asintomatico rispetto al gruppo di controllo. Il gruppo suggerisce che la forte risposta IP10 iniziale nei malati lievi può svolgere un ruolo nel limitare e risolvere la risposta infiammatoria, che è compromessa nei malati più gravi e provoca la tempesta di citochine comunemente segnalata. Il gruppo traccia parallelismi tra il picco osservato nelle cellule T CD38+ CD8 e le cellule dendritiche mature nei malati lievemente precoci con quello osservato negli individui naïve alla SARS-CoV-2 che hanno ricevuto la prima dose del vaccino COVID-19.

Quale sarebbe la migliore strategia di vaccinazione nei guariti?

Le forniture limitate di vaccini in molti paesi hanno portato a un riesame delle politiche di immunizzazione in termini di una seconda dose ritardata o di mettere gli individui naïve a una priorità più alta per la vaccinazione rispetto a quelli con una precedente storia di infezione naturale. Alcuni studi hanno esaminato l’adeguatezza di una singola dose per quest’ultima categoria, alla luce delle attuali prove che dimostrano che la vaccinazione con una sola dose può ancora essere altamente efficace per questi individui. Questa dose singola fungerebbe da eccellente dose di richiamo, mentre due dosi potrebbero portare a un livello di anticorpi eccessivamente elevato. Una tale politica libererebbe anche più dosi. Tuttavia, è chiaro che un tale passo può essere intrapreso solo se sono disponibili prove sufficienti. In effetti, la maggior parte degli studi precedenti a sostegno di questa pratica sono stati limitati a causa della loro piccola dimensione del campione. Di particolare preoccupazione è l’emergere di VOC a rapida diffusione e spesso più virulenti, la maggior parte dei quali ha mutazioni negli epitopi antigenici che sono suscettibile di riconoscimento anticorpale.

I sieri di individui convalescenti e vaccinati sono altamente neutralizzanti contro la variante Alfa, ma non mostrano la stessa attività contro le varianti Beta o Gamma. La variante Delta si è diffusa rapidamente fino a diventare il ceppo dominante in tutto il mondo. Inoltre, studi recenti sembrano suggerire che questa variante offra una resistenza parziale, almeno, agli antisieri convalescenti e vaccinati. Uno studio appena pubblicato ha monitorato per sei mesi circa 580 operatori sanitari in un singolo ospedale in Spagna. Hanno scoperto che uno su cinque di questi lavoratori era sieropositivo per COVID-19 o era risultato positivo per SARS-CoV-2 mediante test RT-PCR, principalmente durante la prima ondata. Gli anticorpi dell’immunoglobulina G (IgG) contro la proteina spike erano presenti fino a sette mesi, così come gli anticorpi neutralizzanti, nella maggior parte di questi individui. I soggetti dello studio sono stati vaccinati con una o due dosi di uno dei vaccini mRNA e la loro risposta anticorpale è stata monitorata.

Dei 414 partecipanti monitorati a un anno dalla prima visita, oltre 340 avevano ricevuto due dosi di vaccino. Di questi operatori sanitari, il 73% era di sesso femminile, mentre il 22% assumeva farmaci cronici. Ancora una volta, uno su cinque aveva una storia di precedente infezione da SARS-CoV2. Si sono verificate 10 infezioni virali 15 giorni dopo la seconda dose, con un periodo mediano di 145 giorni dalla vaccinazione, pari al 6% degli individui completamente vaccinati che hanno manifestato un’infezione acuta. Al contrario, il 7,5% è stato infettato nello stesso periodo. La sieroconversione si è verificata nel 96% dei partecipanti da 10-72 giorni della prima dose, con anticorpi IgA e IgG contro lo spike, il dominio legante il recettore (RBD) e la subunità S2. A 12-19 giorni dalla seconda dose, tutti i partecipanti tranne uno erano sieropositivi. Dopo due dosi, tutti i partecipanti hanno mostrato un aumento degli anticorpi specifici SARS-CoV-2 leganti e neutralizzanti, sebbene i titoli variassero ampiamente. In questo momento sono stati rilevati anticorpi IgG per le varianti di picco Alpha, Beta e Gamma.

Le probabilità che gli anticorpi IgM per le varianti di picco Alpha, Beta e Gamma siano assenti a 2,5, 3,8 e 4,7 volte superiori, rispettivamente, rispetto agli anticorpi IgM contro il virus wild-type. I titoli anticorpali (IgA, IgG e IgM) erano più alti in tutti gli individui con una precedente infezione da SARS-CoV2. In particolare, i titoli di IgG hanno mostrato un aumento di oltre 5,5 volte dopo una dose e un aumento di 1,4 volte dopo due dosi. I livelli erano più alti negli individui precedentemente esposti rispetto a quelli naïve. Questa differenza era simile per tutti e tre i coronavirus. I titoli anticorpali neutralizzanti dopo due dosi del vaccino erano più alti in quelli con una precedente storia di infezione rispetto agli individui naïve, con una maggiore avidità anticorpale sia per IgA che per IgG. Sia i livelli di IgG che di IgA erano collegati ai titoli di neutralizzazione Mentre coloro che erano stati infettati più di 11 mesi prima della vaccinazione avevano livelli di IgA e IgG più elevati rispetto a quelli che erano stati infettati in seguito, questa differenza è svanita quando i titoli sono stati aggiustati per il tempo tra l’infezione e la vaccinazione.

L’infezione sintomatica precedente era associata a titoli anticorpali IgA e IgG più elevati dopo la vaccinazione completa rispetto a coloro che avevano manifestato un’infezione asintomatica sia per il tipo selvatico che per i VOC. Anche la capacità di neutralizzazione era maggiore. L’associazione opposta è stata osservata con gli anticorpi IgM. È stato scoperto che il vaccino Moderna induce titoli IgG e IgA più forti contro lo spike, RBD e S2, con una maggiore capacità di neutralizzazione e avidità, dopo due dosi rispetto al vaccino Pfizer, sia contro il tipo selvatico che contro i VOC. Gli effetti avversi dopo la vaccinazione sono stati anche associati a livelli più elevati di IgA e IgG per wildtype e VOC, rispetto a effetti avversi minori o assenti, dopo una o due dosi. La presenza di questi effetti collaterali era anche legata a una maggiore capacità neutralizzante e avidità di legame. Il fumo è stato associato a una risposta anticorpale inferiore del 43% a una dose di entrambi i vaccini. Dopo due dosi, la presenza di altre condizioni sottostanti negli individui che hanno ricevuto il vaccino Pfizer è stata collegata a una risposta anticorpale più debole del 45% e del 30%.

Un aumento simile nella risposta anticorpale totale e neutralizzante è stato associato a coloro che avevano una storia di infezione precedente, effetti avversi sistemici e una durata maggiore dalla prima dose. Per gli individui naïve, gli effetti avversi sistemici erano importanti solo dopo la seconda dose del vaccino. I livelli di anticorpi contro qualsiasi antigene spike sono rimasti rilevabili fino a un anno, mentre quelli contro la nucleoproteina sono rapidamente scesi al di sotto del limite rilevabile. Negli individui esposti, i livelli di IgG sono rimasti positivi nel 90% dei test.

Come funzionano i nuovi test salivari nella diagnosi?

I livelli di anticorpi salivari sono molte volte inferiori a quelli riscontrati nel siero del sangue, l’immunoglobulina G (IgG) nella saliva proviene principalmente da perdite dalla superficie gengivale e l’immunoglobulina A (IgA) dalle membrane mucose. Tuttavia, i test basati sulla saliva per la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) sono minimamente invasivi rispetto ai tamponi nasofaringei, inoltre costano notevolmente meno in termini di tempo e impegno del personale per la raccolta dei campioni. Pertanto, un metodo di rilevamento affidabile e conveniente che utilizzi solo la saliva sarebbe di grande beneficio durante la pandemia di COVID-19. Ora, in un articolo recentemente caricato sul server di prestampa medRxiv*, è stato sviluppato un nuovo test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) in grado di quantificare i livelli di IgG e IgA nei campioni di saliva che sono stati conservati per diverse settimane. Il test viene quindi impiegato per monitorare i livelli salivari di IgG e IgA dei pazienti COVID-19 nel tempo, trovando una risposta immunitaria diversa tra quelli con malattia lieve o grave.

L’ELISA sviluppato dal gruppo ha utilizzato la forma di prefusione della proteina spike SARS-CoV-2, che è stata rivestita sulla base di una piastra a 96 pozzetti. I campioni sono stati aggiunti alle piastre e incubati per un’ora e gli eventuali anticorpi legati sono stati rilevati e quantificati mediante l’aggiunta di anti-IgA o IgG umane marcate con perossidasi di rafano, generando un indicatore colorimetrico dopo l’aggiunta del colorante 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB). Cento ottantasette partecipanti risultati positivi per COVID-19 mediante RT-PCR hanno donato campioni di saliva una o più volte per cinque settimane. Un secondo gruppo di 98 pazienti è stato coinvolto in uno studio a lungo termine in cui sono stati raccolti diversi campioni in un periodo il più lungo possibile di 203 giorni. I campioni raccolti prima dell’inizio della pandemia di COVID-19 sono stati utilizzati anche come controllo e inizialmente utilizzati per regolare le concentrazioni appropriate di reagenti utilizzati al fine di migliorare la specificità e limitare il rumore di fondo nel test.

Dei 118 casi di COVID-19 inizialmente testati dal gruppo utilizzando il test, in media circa 23 giorni dopo la diagnosi mediante RT-PCR, il 19,5% era positivo solo per IgA contro la proteina spike, il 20,3% solo per IgG e il 46,6% per entrambi, mentre il 13,6% era negativo per eventuali anticorpi. Quando testato su base settimanale, il gruppo nota un tasso più elevato del 28,6% sia per IgG che per IgA nella prima settimana, con IgA che ha poi raggiunto il 62,1% e il 68,6% rispettivamente nelle settimane due e quattro, per poi scendere allo 0% nelle settimane nove e dieci. Al contrario, le IgG sono aumentate all’80% del tasso di positività entro la terza settimana, raggiungendo un picco del 100% entro l’ottava settimana e quindi rimanendo positivo tra quelli testati almeno fino alla settimana dieci. I partecipanti al gruppo di studio a lungo termine sono stati classificati in base alla gravità della malattia, con disparità notate nella risposta anticorpale tra quelli con COVID-19 lieve o grave. I pazienti con malattia lieve avevano un tasso di positività del 33,3% sia per IgG che per IgA una settimana dopo l’insorgenza dei sintomi, con IgA che raggiungeva il 100% di positività alla quarta settimana e poi scendeva allo 0% entro la nona settimana.

Nei pazienti con COVID-19 grave, i livelli di IgA hanno raggiunto il 100% di positività leggermente prima, nella terza settimana, che sono lentamente scesi al basale entro la decima settimana, mentre le IgG hanno raggiunto il picco dell’80% nella quinta settimana e sono rimaste elevate per dieci settimane. ha seguito il tasso di positività tra quelli testati, le IgA con un picco nelle settimane 4-5 e un calo nelle settimane 9-10 e le IgG con un picco leggermente più tardi e un declino più lento per i malati gravi. Titoli e tassi di positività erano costantemente più alti tra i malati gravi rispetto a quelli lievi o asintomatici. Il test sviluppato consente una quantificazione rapida e affidabile di IgG e IgA contro SARS-CoV2 nella saliva, consentendo di dedurre la gravità dell’infezione. Altri rapporti hanno dimostrato che gli anticorpi IgG salivari si correlano bene con i livelli sierici di IgG e, secondo quanto riferito, persistono per diversi mesi dopo l’insorgenza della malattia. L’IgA, tuttavia, diventa spesso non rilevabile nella saliva in 4-6 settimane e spesso mostra solo una moderata correlazione con i livelli sierici.

Il limite di rilevamento riportato per il test ELISA degli autori è 1,98 ng/ml per IgA e 0,3 ng/ml per IgG, un miglioramento rispetto alla maggior parte dei test simili che consente di testare i campioni diverse settimane dopo la raccolta. Ciò può anche fornire un’alternativa adeguata in caso di analisi del sangue non fattibili.

  • A cura del Dr. Gianfrancesco Cormaci, PhD, specialista in Biochimica Clinica.

Pubblicazioni scientifiche

Moncunil G et al. medRxiv 2021 Sept 8; 21263232.

Costantini VP et al. medRxiv, 2021 Sept 3; 21263078.

Capelle CM et al. medRxiv 2021 Aug 31; 21262713.

Levine-Tiefenbrun M. medRxiv 2021 Aug 29; 21252798.

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Yu H Azman AS et almedRxiv 2021 Aug 26; 21262699.

Dott. Gianfrancesco Cormaci
- Laurea in Medicina e Chirurgia nel 1998 (MD Degree in 1998) - Specialista in Biochimica Clinica nel 2002 (Clinical Biochemistry residency in 2002) - Dottorato in Neurobiologia nel 2006 (Neurobiology PhD in 2006) - Ha soggiornato negli Stati Uniti, Baltimora (MD) come ricercatore alle dipendenze del National Institute on Drug Abuse (NIDA/NIH) e poi alla Johns Hopkins University, dal 2004 al 2008. - Dal 2009 si occupa di Medicina personalizzata. - Guardia medica presso strutture private dal 2010 - Detentore di due brevetti sulla preparazione di prodotti gluten-free a partire da regolare farina di frumento immunologicamente neutralizzata (owner of patents concerning the production of bakery gluten-free products, starting from regular wheat flour). - Responsabile del reparto Ricerca e Sviluppo per la società CoFood s.r.l. (leader of the R&D for the partnership CoFood s.r.l.) - Autore di un libro riguardante la salute e l'alimentazione, con approfondimenti su come questa condizioni tutti i sistemi corporei. - Autore di articoli su informazione medica e salute sui siti web salutesicilia.com, medicomunicare.it e in lingua inglese sul sito www.medicomunicare.com
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