Uno studio che esamina le proprietà biofisiche di una proteina anomala che guida le cellule tumorali sta fornendo agli scienziati nuovi indizi terapeutici su come trattare l’ependimoma, il terzo tumore cerebrale infantile più comune. Gli scienziati del St. Jude Children’s Research Hospital stavano studiando come la proteina di fusione ZFTA-RELA, implicata nel 95% degli ependimomi nella corteccia cerebrale, determini la malattia. I risultati dello studio dimostrano che regioni disordinate (random coiled) della proteina di fusione causano la formazione di goccioline all’interno delle cellule chiamate condensati. I ricercatori hanno rivelato che questi “organelli senza membrana” sono essenziali per lo sviluppo dell’ependimoma.
Gli scienziati hanno iniziato il loro studio esaminando le diverse regioni della proteina di fusione ZFTA-RELA. ZftA è un fattore di trascrizione che si prevede sia coinvolto nella regolazione negativa della trascrizione basata sul DNA, mentre Rel A è un membro della famiglia dei fattori di trascrizione NF-kB. Hanno scoperto che la porzione ZFTA, che lega direttamente il DNA, era necessaria per lo sviluppo del cancro. La porzione RELA contiene una regione altamente disordinata, il che significa che è priva di una struttura rigida e può muoversi in modo flessibile, ed era necessaria per la formazione del condensato. I condensati sono un modo in cui le cellule organizzano le molecole responsabili dello svolgimento di vari compiti.
Quando la regione disordinata RELA era assente, i condensati non si formavano e l’ependimoma non si sviluppava nei topi. Tuttavia, quando gli scienziati hanno scambiato la porzione RELA con altre regioni proteiche disordinate non correlate, le nuove fusioni formavano comunque condensati, guidando l’espressione dell’oncogene che ha portato allo sviluppo del tumore cerebrale. Nell’ependimoma, i condensati assemblano le molecole responsabili dell’espressione genica. All’interno dei condensati, la porzione ZFTA della proteina di fusione guida il complesso verso il DNA che codifica per alcuni oncogeni. I ricercatori hanno dimostrato che questo processo anomalo è necessario per la formazione dell’ependimoma, suggerendo che potrebbe essere interrotto dai farmaci.
Già i fattori di trascrizione sono proteine per le quali lo sviluppo o l’identificazione di tasche molecolari in grado di accogliere molecole è molto difficile; pensare di trovare una molecola che interferisca con un prodotto di due proteine, è ancora più difficile. Ma non è detto che sia impossibile: potrebbe essere possibile farlo in modo indiretto. Le scoperte su qusta chimera proteica indicano che, invece di focalizzarsi sulla proteina stessa, conoscere i partners molecolari di come essa lavora dentro i condensati potrebbe rivelarsi più facile. Si pensi alle istone deacetilasi (HDACs) che modificano proteine associate al DNA in modo da permettere l’entrata dei fattori di trascrizione nella cromatina. Esse sono cofattori di svariate proteine nucleari difficili da bersagliare con molecole conosciute.
Ma bloccare le HDACs con vari farmaci già esistenti (usati in campo oncologico), permette di ottenere effetti simili allo impedire a quei fattori di trascrizione che le usano di arrivare a lavorare sul DNA. Conoscere l’identità dei partners di ZFTA-RELA dentro i condensati può rivelare proteine già conosciute e per le quali ci sono molecole inibitorie a disposizione o note. Sebbene il lavoro sia stato condotto sull’ependimoma, anche altri tumori causati da altre proteine di fusione potrebbero presentare una vulnerabilità simile. Il tipo più comune di tumore cerebrale nei bambini, l’astrocitoma pilocitico (PIAS), rappresenta circa il 15% di tutti i tumori cerebrali pediatrici.
Sebbene questo tipo di tumore non sia solitamente pericoloso per la vita, la crescita incontrollata delle cellule tumorali può compromettere il normale sviluppo e la funzione cerebrale per fenomeni compressivi o di infiltrazione. Il PIAS spesso presenta delle proteine di fusione come causa oncogenica, come la chimera KIAA1549-BRAF, o la GNAI3-BRAF o ancora la GIT2-BRAF. Tutte esse sono accomunate dalla porzione BRAF, che codifica la proteina chinasi B-Raf altamente espressa nelle cellule nervose e del midollo osseo e che è cugina di c-Raf1, l’ubiquitario attivatore delle MAP-chinasi ERKs implicate nella proliferazione cellulare.
Nelle chimere BRAF, la porzione chinasica della proteina è mantenuta ed è funzionante: questo vuol dire che ipoteticamente bloccando la regione BRAF con un inibitore specifico si potrebbe mettere fuori uso la chimera stessa. Questo è in parte vero, poiché la funzione chinasi della chimera è sempre richiesta per l’effetto oncogeno, ma quale funzione aberrante possegga l’altra metà della chimera non è sempre chiaro nel contesto di una proteina che prima faceva un lavoro e adesso ne fa uno potenzialmente diverso. Inoltre, in un piccolo numero di casi sono stati identificati otto geni partner per le fusioni di BRAF (FAM131B, RNF130, CLCN6, MKRN1, GNA11, QKI, FZR1 e MACF1), tutti con conseguente perdita della regione regolatrice N-terminale della proteina BRAF ma col mantenimento del dominio chinasi.
Queste alterazioni si verificano attraverso vari meccanismi genetici, tra cui delezioni e traslocazioni. L’identificazione della fusione KIAA1549-BRAF è stata utilizzata come marcatore diagnostico per il PIAS, sebbene alcuni studi suggeriscano che questa fusione possa verificarsi raramente anche nei gliomi astrocitari diffusi dell’adulto, inclusi gli oligodendrogliomi, insieme alla perdita di 1p e 19q e alla mutazione dell’enzima mitocondriale IDH1. Sfortunatamente, le fusioni tra KIAA1549 e BRAF, sebbene tutte presentino un frame di lettura aperto e codifichino per una proteina di fusione, incluso il dominio chinasi di BRAF, possono essere derivate da almeno nove diverse combinazioni di siti di fusione.
Oltre alle rare varianti di fusione di BRAF descritte sopra, sono state osservate aberrazioni ricorrenti che colpiscono le chinasi del recettore della famiglia FGFR1 e NTRK. Per i geni NTRK, queste alterazioni si presentavano sotto forma di fusioni geniche, con i diversi partner 5′ che presentavano un dominio di dimerizzazione che si presumeva portasse alla dimerizzazione costitutiva e all’attivazione della chinasi. È interessante notare che fusioni simili sono state recentemente descritte anche in un sottoinsieme di gliomi infantili di alto grado. Per FGFR1, i cambiamenti erano più vari, tra cui mutazioni puntiformi (N546K, K656E); fusioni FGFR1-TACC1 simili a quelle osservate nel glioblastoma adulto; e una nuova duplicazione interna del dominio chinasi (caso del FGFR1-ITD).
In un contesto morfologico appropriato, la presenza di queste alterazioni genetiche (in particolare la fusione KIAA1549-BRAF) può essere utilizzata, insieme ad altri reperti, per supportare la diagnosi di PA. È chiaro, tuttavia, che l’assenza di tale fusione non fornisce alcuna informazione diagnostica, poiché sono stati riscontrati molti altri modi in cui la via di segnalazione delle MAP chinasi viene attivata negli astrocitomi pilocitari. Sfortunatamente, molte delle alterazioni non KIAA1549-BRAF risultano ugualmente aberranti anche nei tipi di tumore che rientrano frequentemente nelle diagnosi differenziali da considerare quando si ha a che fare con un caso difficile. I risultati molecolari hanno portato a studi clinici preliminari sugli inibitori di BRAF o su target più a valle della via della MAP chinasi.
Studi iniziali con inibitori di BRAF sono stati pubblicati e hanno dimostrato la comprensione incompleta del modo in cui gli inibitori influenzano i componenti della via della MAP chinasi, nonché le connessioni tra questa via e la via PI3K/AKT/mTOR. Il trattamento con sorafenib (inibitore generale di Raf) in una piccola serie di pazienti ha prodotto un’inaspettata accelerazione della crescita tumorale, indipendentemente dal fatto che il tumore presentasse una mutazione di BRAF. Studi in vitro hanno mostrato un’attivazione paradossa di ERK da parte di sorafenib in assenza di NF1 wild-type, e l’inibitore di B-Raf PLX4720 ha anche mostrato un’attivazione paradossa della via della MAP chinasi nelle cellule che esprimono la proteina di fusione KIAA1549-BRAF.
Ciò può essere spiegato dal fatto che nei dimeri BRAF/RAF, dove uno dei due protomeri ha legato il farmaco, il RAF non legato al farmaco diventa altamente attivato con un aumento della segnalazione ERK, che induce proliferazione cellulare. Il punto centrale, resta comunque svelare quali partner queste chimere usano nel nucleo cellulare per svolgere le loro funzioni. Nel caso dell’ependimoma, ci sono dati nuovi sulla possibile identità di alcuni di essi. In questo tumore cerebrale, che fortunatamente è relativamente benigno e risponde molto bene al trattamento chirurgico, esiste spesso una fusione fra la proteina YAP (del segnale cellulare Hippo) e proteine come MAML1 che provocano la formazione di condensati macromolecolari come descritto sopra.
Test di mutagenesi e chimere dimostrano che una regione intrinsecamente disordinata promuove l’oligomerizzazione delle fusioni YAP in condensati nucleari, puntiformi, privi di membrana. L’oligomerizzazione e la formazione di condensati nucleari indotti dalla fusione di YAP con l’attivatore trascrizionale GCN4 promuovono anche la formazione di ependimomi. YAP-MAMLD1 concentra fattori di trascrizione e co-attivatori, tra cui BRD4, MED1 e TEAD, nei condensati, escludendo PRC2, che agisce come repressore trascrizionale, e induce interazioni enhancer-promotore a lungo raggio che promuovono la trascrizione e i programmi oncogenici. Il blocco dell’attività del co-attivatore trascrizionale mediata dai condensati inibisce la tumorigenesi.
Nell’ependimoma è stata registrata anche la chimera C11orf95-RELA, che si trasloca spontaneamente nel nucleo per attivare i geni bersaglio NF-κB e trasforma rapidamente le cellule staminali neurali (la cellula di origine dell’ependimoma) per formare questi tumori nei topi. In questo caso è possibile bersagliare questa chimera con inibitori diretti dell’NF-kB, che purtroppo non esistono ancora in ambito clinico perché la ricerca ha sempre disattivato questo fattore di trascrizione attaccando le chinasi attivatrici a monte (IKK-alfa, IKK-beta, NIK e NEMO). Purtroppo chimere come queste sfuggono a questa regolazione, perché si traslocano autonomamente nel nucleo senza bisogno di essere fosforilate.
È noto che la molecola chiamata JSH-23 è un inibitore diretto dell’attività trascrizionale dell’NF-kB, ma non è mai stata testata nell’ambito sperimentale o clinico per il trattamento dei tumori cerebrali. Lo stesso vale per il composto SC-75741, che è usato in laboratorio per studiare l’NFkB ed inibisce proprio l’attività trascrizionale di p65(Rel A) con buona efficacia. Per contro, è noto quali coattivatori nucleari usa l’NFkB. Tra i coattivatori più importanti che “fanno squadra” con NFκB ci sono componenti della famiglia delle CBP come la p300 e proteine della famiglia p160 (come SRC-1, GRIP1/TIF2 e NCoA3/AIB-1), che sono coattivatori usati anche dai recettori nucleari per gli ormoni steroidei (estrogeni, corticosteroidi) e tiroidei.
Non casualmente, fra la terapia antitumorale di gestione dei tumori cerebrali sono compresi i cortisonici, che svolgono azione anti-crescita, antinfiammatoria ed anti-edema dovuta all’espansione della massa maligna. Glucocorticoidi come desametasone e prednisone sono usati nella terapia dei tumori cerebrali: essi antagonizzano direttamente l’NFkB tramite il loro recettore GR-alfa attivato, togliendo in sol colpo sia l’infiammazione (con l’edema) e il vantaggio di proliferazione della massa tumorale. Sono noti degli inibitori dei coattivatori nucleari (CIBs) come EX-11 e G5, che sono piccole molecole idrofobe sperimentate in laboratorio per studiare l’interazione fra i recettori degli estrogeni e degli androgeni con i loro coattivatori della famiglia p160.
C’è poi SI-2, che è stato ingegnerizzato per colpire NCoA3 nel contesto del cancro mammario. Un altro nome di questa proteina, infatti, è AIB-1 (Amplificato in Breast Cancer-1). La molecola ha buona affinità ed è risultata attiva nelle cellule tumorali MDA-MB-486, che hanno iper-espressione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR). Non hanno finora ricevuto attenzione in campo oncologico clinico perché esistono farmaci antagonisti di questi ormoni, che sono usati correntemente nella terapia sia del carcinoma mammario che della prostata. Una migliore comprensione, tuttavia, delle regolazioni fini a carico dei coattivatori nucleari potrebbe permettere in un vicino futuro la sintesi di molecole specifiche che colpiscano i coattivatori nel contesto delle chimere oncògene, per impedire che queste portino a termine la loro trascrizione genica aberrante.
- A cura del Dr. Gianfrancesco Cormaci, PhD, specialista in Biochimica Clinica.
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